Nouvelles technologies pour l'électrophorèse

Nov 10, 2023

Angelo DePalma est un écrivain indépendant vivant à Newton, New Jersey. Vous pouvez le joindre à [email protected].

Conçue à la fin des années 1980, l'idée du "laboratoire sur puce" cherchait à créer l'équivalent d'un laboratoire d'analyse complet sur des dalles de silicium, de verre et de plastique de la taille d'une pochette d'allumettes. La plupart de ces dispositifs étaient basés sur l'électrophorèse capillaire, un mode analytique qui reste dominant dans les dispositifs analytiques microfluidiques.

Le rêve de fabriquer quoi que ce soit ressemblant à un laboratoire entier sur un substrat de la taille d'une boîte d'allumettes ne s'est jamais réalisé, mais une instrumentation commerciale est apparue qui effectue une électrophorèse simple sur des puces. Ceux-ci servent principalement les sciences de la vie, y compris les diagnostics médicaux. Un rapport d'étude de marché estime un taux de croissance annuel robuste de sept pour cent pour ces systèmes.

PerkinElmer propose deux plateformes d'électrophorèse microfluidique : l'analyseur d'acides nucléiques LabChip® GX Touch™ pour l'ADN et l'ARN, et le système de caractérisation des protéines LabChip® GXII Touch™ pour les protéines et les glycanes. Les deux systèmes fournissent des plates-formes à haut débit pour la séparation, le dimensionnement et la quantification de biomolécules par électrophorèse. PerkinElmer a développé des méthodes de microfabrication spéciales qui intègrent des canaux de taille micrométrique dans des micropuces de verre et de quartz minces. Les micropuces s'interfacent avec l'instrument via des caddies en plastique pour faciliter le chargement et l'engagement de l'échantillon avec l'instrumentation.

« Les principaux avantages de l'analyse de biomolécules basée sur la microfluidique par rapport à celle basée sur le gel sont le débit, la résolution, la facilité d'utilisation, la sensibilité et la polyvalence », déclare James Atwood PhD, directeur général de l'automatisation et de la microfluidique chez PerkinElmer. "L'électrophorèse sur gel traditionnelle prend du temps, demande beaucoup de travail, est sujette à la variabilité et consomme de grandes quantités d'échantillons précieux."

Les tests basés sur la microfluidique LabChip ne consomment que 150 nanolitres d'échantillon par séparation et sont compatibles avec les échantillons d'acide nucléique et de protéines dans les plages de concentration faibles en pg/μL et ng/mL, respectivement. Le débit allant jusqu'à 384 échantillons par cycle pour LabChip dépasse de loin celui des systèmes à base de gel et des biomolécules, telles que les glycanes liés à l'azote, qui ne sont pas modifiables par une séparation à base de gel par électrophorèse mais peuvent être séparés et détectés dans des systèmes microfluidiques. Un autre avantage important de la séparation des biomolécules à base microfluidique est la séparation et la quantification des protéines natives, basées sur la charge seule, pour détecter les variantes de charge. L'électrophorèse sur gel ne peut pas résoudre les variantes de charge des protéines.

Dans les workflows typiques de spectrométrie de masse basés sur l'électrophorèse sur gel, les composés sont d'abord séparés dans le gel, puis les bandes correspondant aux biomolécules d'intérêt sont excisées. Dans les flux de travail protéomiques, les protéines sont dégradées par voie enzymatique et les fragments peptidiques sont extraits du gel avant la LC-MS/MS. Bien que cette approche présente un certain nombre d'avantages, notamment le fait d'être un mode de séparation orthogonal, elle est extrêmement fastidieuse.

Plusieurs systèmes basés sur la microfluidique ont été développés qui permettent le couplage direct d'une puce microfluidique à un système HPLC et un spectromètre de masse. Dans ces systèmes de microchromatographie, les canaux microfluidiques sont garnis d'une phase stationnaire spécifique au mode de séparation souhaité. Cela permet la capture et/ou la séparation automatisées des biomolécules directement sur la puce avec élution, ionisation et détection dans le spectromètre de masse. Contrairement aux approches à base de gel, les systèmes de microchromatographie sont compatibles avec l'automatisation et peuvent être adaptés pour cibler des biomolécules spécifiques d'intérêt en fonction de la modification du matériau d'emballage.

Les puces utilisées avec le système Agilent 2100 Bioanalyzer se composent d'un chariot en plastique avec 16 puits utilisés pour l'application de réactifs et d'échantillons. Chaque puce est étiquetée avec des identifiants pour le type de test, le numéro de lot et la configuration de puce spécifique au test. La puce de verre intègre des microcanaux gravés et est collée à l'arrière du boîtier. "Le processus de production de la puce de verre et du canal de séparation est similaire à celui des dispositifs à semi-conducteurs", explique Eva Graf, chef de produit pour les bioanalyseurs chez Agilent Technologies (Santa Clara, CA). Agilent utilise des masques de protection spéciaux pour les puces de protéines et d'acides nucléiques, qui reflètent la structure du canal. Lorsque les éclats de verre sont exposés à l'agent de gravure, seuls les canaux sont gravés dans le verre. La surface restante de la puce est protégée par le masque.

Le système de microcanaux relie tous les puits du chariot avec la croix d'injection et le canal de séparation. Avant d'appliquer les échantillons, les microcanaux sont remplis d'un mélange de gel séparateur et de colorant fluorescent. Pendant l'exécution de la puce, une haute tension est appliquée en plusieurs étapes selon un script spécifique au test reflétant la disposition des microcanaux dans la puce de verre. "Le script coordonne le pré-tirage, l'injection électrocinétique et, bien sûr, la séparation électrophorétique des échantillons", explique Graf. "La séparation électrophorétique simultanée et le pré-tirage de l'échantillon suivant réduisent le temps d'analyse à quelques minutes par échantillon." Les analytes séparés sont ensuite détectés dans le canal de séparation par fluorescence induite par laser et le signal est traduit en images de type gel et en électrophérogrammes.

L'électrophorèse sur puce permet une séparation hautement résolutive ne nécessitant qu'un volume d'échantillon minimal, ce qui rend la technologie attrayante pour le contrôle qualité d'échantillons précieux avant toute application en aval.

Pour Agilent, les principales applications d'électrophorèse sur puce incluent le contrôle de la qualité des bibliothèques dans les flux de travail de séquençage de nouvelle génération. Selon Graf, un calcul précis de la distribution de taille et de la concentration de l'échantillon avant le séquençage est crucial pour obtenir une densité de grappes optimale, et l'évaluation de la quantité et de la qualité du matériel de départ expérimental est essentielle au succès de la recherche. "Lorsque vous utilisez l'ARN comme matériau de départ pour l'analyse de l'expression génique à l'aide de NGS, de puces à ADN ou de qPCR, la dégradation de la RNase est une raison fréquente d'échecs d'expériences. Les tests d'ARN sur puce facilitent la détection visuelle des effets de dégradation, même minimes, et l'intégrité de l'ARN nombre permet une qualification objective de l'échantillon."

En revanche, l'électrophorèse sur gel traditionnelle ne permet qu'une estimation de l'intégrité de l'échantillon, qui est sujette à une interprétation dépendante de l'utilisateur. « Une sensibilité élevée et une large gamme dynamique linéaire des tests d'ADN en font un outil optimal pour analyser des fragments amplifiés par PCR ou digérés par des enzymes de restriction, et permettent une évaluation facile de l'efficacité du clivage de l'ARNg synthétisé dans l'édition du génome », déclare Graf.

Du côté de l'analyse des protéines, les EPC offrent un moyen rapide et fiable de remplacer les méthodes analytiques SDS-PAGE. Les applications typiques incluent l'évaluation de la taille, de la pureté et de la concentration des protéines lors de processus tels que l'expression de protéines recombinantes, la purification des protéines, les études de stabilité ou l'analyse générale des anticorps.

Les responsables de laboratoire évaluent l'instrumentation en fonction de ses capacités, et non de son facteur de buzz. Les acheteurs de systèmes à base de puces doivent donc s'assurer que les systèmes envisagés fournissent la profondeur et l'étendue des analyses qu'ils prévoient d'exécuter.

Graf recommande des systèmes qui offrent des tests "appropriés à votre type d'échantillon, en particulier en ce qui concerne la concentration de l'échantillon, la taille de l'échantillon, le type d'échantillon (ADN, ARN, protéine, etc.)", toujours avec un œil sur le débit de l'échantillon. "En outre, tenez compte des services du fournisseur pour l'assistance, la garantie, la réparation et l'installation, ainsi que de la facilité d'utilisation du système, qui peuvent tous contribuer à réduire au minimum les temps d'arrêt du laboratoire."

Les volumes d'échantillons sont devenus un argument de vente majeur avec tous les instruments d'analyse. Des volumes plus petits consomment moins de réactifs et moins d'échantillons, et permettent aux chercheurs d'en faire plus avec des échantillons rares ou rares. Le bioanalyseur 2100 d'Agilent, par exemple, ne nécessite qu'un microlitre d'échantillon pour les dosages d'ARN et d'ADN.

La conformité réglementaire est un problème pour les laboratoires de R&D pharmaceutique, 21 CFR partie 11 étant la réglementation applicable couvrant les enregistrements électroniques. La conformité joue également un rôle dans les opérations standard des laboratoires de diagnostic et de toute installation ayant une interaction continue avec le brevet ou le système juridique, par exemple, la médecine légale.

Le coût est toujours une considération, mais pour les instruments que les laboratoires utilisent quotidiennement, le coût de possession doit être pris en compte en ce qui concerne la consommation d'énergie et de réactifs. Les plans de service ont tendance à être complets, avec une réponse généralement rapide, mais les laboratoires très occupés doivent également tenir compte de l'impact économique des temps d'arrêt.